Interamente di mano dell’urbinate Federico Barocci detto il Fiori (1528-1535 – 1612), uno dei pittori più importanti nel periodo dell’arte durante la Controriforma, che intercorre fra Correggio  e Caravaggio, l’Immacolata Concezione (olio su tela, cm 217 x 144), che risale al 1575 circa, in origine era nata come una Madonna della Misericordia, tipica della cultura quattrocentesca, ma venne modificata e trasformata nell’Immacolata. La Vergine, in un turbinio di nubi, è circondata da angeli; raffinatissima è la resa del panneggio. L’eleganza dei gesti accentua il dialogo con i fedeli e diminuisce la distanza tra essi e Maria. Particolarmente intensi sono i ritratti dell’uomo e della donna che occupano il primo piano dell’opera, probabilmente si tratta dei committenti. L’uomo indossa una casacca color ocra da cui spunta una gorgiera bianca, mentre la donna, elegantemente abbigliata, stringe la figlia, che, timorosa, osserva la Vergine Maria, in una generale atmosfera di poetico intimismo. L’opera proviene dalla chiesa di San Francesco di Urbino e giunse nelle collezioni della Galleria Nazionale delle Marche in seguito alla soppressione dei conventi avvenuta dopo l’Unità d’Italia.